در این مطلب می خواهیم در مورد مایکوپلاسما صحبت کنیم. مایکوپلاسما یک باکتری بدون دیواره است به همین علت نسبت به آنتی بیوتیک پنی سیلین و سایر آنتی بیوتیک هایی که روی دیواره اثرگذارند، حساس نیست. همچنین مایکوپلاسم ها در محیط کشت باعث تغییر متابولیسم،کاهش تکثیر و تغییرات کروموزومی می شود.به همین علت مهم است که واکسن ها،محیط های کشت سلولی،محیط کشت های ویروسی از آلوده نبودن به این باکتری تست شود. در واقع آلودگی محیط های کشت به مایکوپلاسما مشکلی گسترده است که افراد در طی تست های خود بر روی پروژه های کشت سولولی با آن روبه رو می شوند. اما چرا این اتفاق می افتد؟ در ادامه همراه با شرکت بازگانی ثنا شیمی که برترین سایت فروش مواد شیمیایی آزمایشگاهی را دارد، باشید تا بیشتر در رابطه با این موضوع توضیح دهیم.
نام مایکوپلاسما به دلیل ساختار قارچ مانند آن با ساختار پلاسمایی انتخاب شدو همانطور که در ابتدای متن هم گفتیم مایکوپلاسما نوعی باکتری است که تفاوت آن با سایر باکتری‌ها، عدم وجود دیواره سلولی و غشای انعطاف‌پذیر در آن می باشد. همچنین اندازه کوچک مایکو پلاسما، دلیل اصلی فرار آنها از طریق سیستم های فیلتر و همچنین رشد آنها در غلظت بالا در کشت سلولی پستانداران بدون هیچ کدورت یا سایر علائم آشکار است.
علل آلودگی مایکوپلاسما
مهم ترین علل آلودگی محیط کشت سلولی به مایکوپلاسماها عبارت است از:
محیط مانند سرم یا معرف های آلوده به مایکوپلاسما
مایکوپلاسماها می توانند به غشاهای فیلتر مورد استفاده در استریل کردن محیط های کشت سلولی، سرم ها و سایر معرف ها نفوذ کنند چراکه به دلیل عدم وجود دیواره سلولی، بسیار کوچک و انعطاف پذیر هستند. بنابراین محیط های کشت سلولی و محصولات حیوانی مورد استفاده در کشت سلولی، باید به عنوان مسیرهای اصلی آلودگی مایکوپلاسما در نظر گرفته شوند.
در اکثر آزمایشگاه‌های کشت سلولی، استفاده از غشاهای صافی با اندازه منافذ ۰.۲ میکرومتر، برای فیلتر کردن محیط‌ یا محلول‌های دیگر رایج می باشد؛ اما این روش برای محلول هایی با سطوح پایین مایکو پلاسما نسبتاً ایمن است.
از طرفی، فیلتر کردن سرم ها یا محصولات خام مشتق شده از حیوانات توصیه نمی شود زیرا آلودگی مایکوپلاسما به طور نهفته
می تواند در آنها زیاد باشد.
پس برای حذف مایکو پلاسما با فیلتراسیون، روش فیلترینگ نقش مهمی دارد که استفاده کردن از سیستم های دیفرانسیل فشار پایین نسبت به سیستم‌های فیلتری فشار بالای ۲۰ psi، کمتر احتمال دارد مایکوپلاسما را از طریق غشاء وارد کند. همچنین در شرایط مشکوک، باید از فیلترهایی با اندازه منافذ ۰.۱ میکرومتر به جای فیلترهای ۰.۲ میکرومتر استفاده شود
لوازم، رسانه ها و محلول های غیر استریل
عقیم سازی نامناسب، منبع اصلی آلاینده های بیولوژیکی است؛ بسته بندی بیش از حد در اتوکلاو یا اجاق با حرارت خشک، باعث گرم شدن ناهموار و در نتیجه ایجاد جیب های مواد غیر استریل می شود. استفاده از چرخه استریلیزاسیون خیلی کوتاه نیز به ویژه برای اتوکلاو کردن مایعات بیش از ۵۰۰ میلی لیتر در هر ظرف یا محلول های حاوی جامدات یا مواد چسبناک مانند آگار یا نشاسته، اشتباهات دیگری هستند که منجر به عقیم سازی نادرست می شوند. نگهداری لوازم و محلول های استریل شده در یک منطقه عاری از گرد و غبار و حشرات یک الزام برای جلوگیری از آلودگی مجدد است.
پرسنل آزمایشگاه
پرسنل آزمایشگاه به عنوان منبع اصلی آلودگی مایکوپلاسما در نظر گرفته می شوند .در سال ۱۹۷۶ نقش تکنسین های آزمایشگاهی در آلودگی مایکوپلاسما در کشت سلولی به اثبات رسید. نشان داده شد که اکثریت (۸۰.۶%) تکنسین ها ناقل مایکو پلاسما، در درجه اول بودند. از عمده روش‌های انتشار مایکوپلاسما از طریق پرسنل عبارت است از: صحبت کردن، عطسه، لباس های خیابان و کت های کثیف آزمایشگاهی که دارای گرد و غبار و ذرات معلق در هوا هستند.
نیتروژن مایع
نیتروژن مایع یکی دیگر از دلایل انتشار می باشد؛ بنابراین، نگهداری کرایویال ها در فاز بخار مخازن نیتروژن به شدت توصیه می شود .
ذرات معلق در هوا
هوای یک اتاق یا آزمایشگاه مهر و موم شده تقریباً عاری از آلاینده های بیولوژیکی است که به محض ورود افراد به اتاق، ذرات ته نشین شده به راحتی دوباره معلق می شوند. همچنین برخی از تجهیزات و فعالیت ها مانند دستگاه های پیپتینگ، پمپ های خلاء و آسپیراتورها، سانتریفیوژها، مخلوط کن ها، دستگاه های صوتی و منابع گرمایی مانند رادیاتور، اجاق، یخچال و فریزر، ذرات میکروبی و ذرات معلق در هوا را تولید می کنند. منبع دیگر ذرات معلق در هوا، حیوانات آزمایشی هستند که خانه و امکانات نگهداری آنها باید تا حد امکان دور از محل کشت سلولی باشد.
استفاده بیش از حد از آنتی بیوتیک ها
استفاده از آنتی بیوتیک ها در کشت سلولی برای جلوگیری از آلودگی میکروبی در آزمایشگاه های تحقیقاتی یکی از رایج ترین عوامل آلودگی محیط کشت سلولی به مایکوپلاسما می باشد. پیامد استفاده بیش از حد از آنتی بیوتیک ها، پنهان کردن تکنیک ضعیف آسپتیک است و علت اصلی کشت های آلوده به مایکوپلاسما می باشد.
آب بندی نامناسب ظروف کشت
یکی دیگر از راه های ورود آلودگی میکروبی در فلاسک ها، بشقاب ها و ظروف، مهر و موم نامناسب ظروف کشت است. مسیر آلودگی میکروبی زمانی فراهم می شود که دیواره های جانبی بالا و پایین ظروف یا فلاسک ها و درپوش آنها خیس شده تا
میکروب ها با عمل مویرگی به سطح مرطوب منتقل شوند.
روش های پیشگیری از آلودگی مایکوپلاسما در کشت سلولی
تکنیک ها و شیوه های آسپتیک را بهبود بخشید
نظارت دقیق بر کارگران جدید در آزمایشگاه توسط یک اپراتور ماهر برای پیروی از تکنیک های خوب آسپتیک می تواند به کاهش خطر آلودگی مایکوپلاسما کمک کند. تهیه گزارش تمام حوادث آلودگی سلولی برای حل مشکل آلودگی بسیار توصیه می شود.
کشت ها را برای آلودگی آزمایش کنید
از آنجایی که یکی از منابع اصلی مایکوپلاسما، کشت های سلولی است که از خارج آورده می شود، پیشنهاد می شود سلول ها را از بانک های سلولی قابل اطمینان تامین کنید.
در صورت وجود کشت سلولی آلوده به مایکوپلا سما در قرنطینه و عدم وجود انکوباتور جداگانه، فقط باید از فلاسک های داخل جعبه پلاستیکی درب دار استفاده شود. هرگز از بشقاب ها و ظروف بدون مهر و موم در قرنطینه استفاده نکنید.
فقط از آنتی بیوتیک ها در صورت لزوم استفاده کنید
در این بخش باید استفاده از آنتی بیوتیک ها در کشت سلولی را محدود کنید چراکه ممکن است محیط کشت سلولی به چهار روش آلوده شود که عبارت است از:
حساسیت به آنتی بیوتیک ها
مقاومت به آنتی بیوتیک ها
مقاومت نسبی به آنتی بیوتیک ها
مقاومت به آنتی بیوتیک ها فقط توسط مایکوپلاسما
در این میان آلودگی مورد چهارم بدترین آلودگی بشمار می رود چراکه سبب پخش شدن مایکوپلاسما در تمام سطح کشت سلولی
می گردد.
سلول های آلوده به مایکوپلاسما را دور بریزید یا درمان کنید
اگر سلول‌های آلوده به مایکوپلاسما ارزشمند و نادر هستند، توصیه می شود که محیط کشت عاری از مایکوپلاسما باشد در غیر این صورت، سلول های آلوده به مایکو پلاسما را دور بریزید زیرا آنها به عنوان منبع آلودگی در آزمایشگاه در نظر گرفته می شوند.
سلول های جدید با هر منشا را قرنطینه کنید
سلول های جدیدی که از آزمایشگاه های دیگر آورده شده اند به عنوان منبع اصلی آلودگی شناخته می شوند؛ بنابراین لازم است سلول‌ها را قرنطینه کرده و آلودگی مایکوپلاسما را قبل از استفاده برای هر منظوری بررسی کنید .
روش های شناسایی آلودگی مایکوپلاسما در کشت سلولی
اولین روش استفاده از کشت میکروبیولوژیکی
یکی از روش های تایید شده رسمی برای تشخیص آلودگی مایکوپلاسما در کشت سلولی می باشد. در این روش یک نمونه از مایع که روی سطح کشت سلولی وجود دارد به محیط مایع برای کشت مایکو پلاسما اضافه می شود. در ادامه پس از چند روز، نمونه ای از مایع رویی کشت سلولی در محیط مایکوپلاسما آگار کشت می شود و در شرایط هوازی در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد به مدت دو هفته انکوبه می شود. روش کشت میکروبیولوژیکی یک استاندارد طلایی برای تشخیص هر نوع آلودگی مایکو پلاسما در کشت سلولی بدون در نظر گرفتن منشاء و گونه مایکوپلاسما است.
دومین روش تایید شده، رنگ آمیزی DNA
در این روش با رنگ آمیزی DNA توسط فلوروکروم هایی مانند DAPI و رنگ آمیزی Hoechst محیط های کشت سلولی آلوده به مایکوپلاسما تشخیص داده می شود. این روش اگرچه آسان و سریع است، اما گاهی اوقات تفسیر نتایج دشوار می شود که برای آن نیازمن تجربه بالاست.
سومین روش تایید شده، PCR
روش استفاده از PCR بسیار آسان، حساس، سریع، قابل اعتماد، کارآمد و مقرون به صرفه است که بر اساس تشخیص مولکول های ۱۶SrRNA ، انجام می شود.
پیامدهای آلودگی مایکوپلاسما در کشت سلولی
از مهم ترین پیامدهای آلودگی مایکوپلاسما در کشت سلولی میتوان به موارد زیر اشاره کرد:
رشد بیش از حد مایکوپلاسما می تواند منجر به از دست دادن کشت سلولی و زوال برگشت ناپذیر سلول های یوکاریوتی شود. رفتار مایکوپلاسماها در کشت سلولی متفاوت است.
فعالیت آرژنین و همچنین جذب و تخلیه محیط رشد توسط مایکو پلاسما می تواند از تکثیر سلولی جلوگیری کرده و باعث القای آپوپتوز در رده های سلولی شود. کاهش آرژنین نیز منجر به غیر طبیعی شدن سرعت رشد، کاهش قابلیت زنده‌ ماندن، جدا شدن سلول‌های چسبنده از سطح رگ کشت سلولی و دانه‌ بندی سلول‌ها ‌شود.
از دیگر اثرات گونه های مختلف مایکو پلاسما بر روی کشت سلولی، شکستگی کروموزوم، رویدادهای جابجایی متعدد و تغییرات عددی کروموزوم می باشد.
پس به طور کلی عوارض جانبی آلودگی مایکوپلاسما بر روی کشت سلولی عبارت است از:
مهار تکثیر
. افزایش مرگ سلولی
. قطعه قطعه شدن DNA
ویژگی های مورفولوژیکی آپوپتوز
حذف آلودگی مایکوپلاسما در کشت سلولی
از مهم ترین راه های حذف آلودگی مایکوپلاسما در کشت سلولی شامل روش‌های فیزیکی (مانند اتوکلاو)، شیمیایی (مانند درمان با مواد شوینده)، ایمونولوژیک (مانند آنتی‌سرم‌های اختصاصی مایکو پلاسما، عبور در موش‌های برهنه، ماکروفاژها) و شیمی‌ درمانی (مثلاً آنتی‌بیوتیک)
البته تاکنون هیچ روش مؤثر و سازگاری برای ریشه‌کنی مایکوپلاسما در همه موارد وجود ندارد اما مطمئن ترین روش در حذف مایکوپلاسما تجویز آنتی بیوتیک است که سه روش مختلف برای درمان سلول های آلوده به مایکو پلاسما با آنتی بیوتیک ها وجود دارد:
استفاده از کینولون ها به عنوان یک ترکیب آنتی بیوتیکی.
استفاده از دو آنتی بیوتیک مختلف مانند پلاسموسین.
استفاده از ترکیب مینوسیکلین (در گروه تتراسایکلین) و تیامولین (در گروه ماکرولید) در چرخه های متناوب با
BM-Cyclin
سخن پایانی
اکنون شما با مبحث آلودگی محیط کشت سلولی به مایکوپلاسما ها آشنا هستید چراکه در این مطلب به مباحث مهم این موضوع پرداخته شد.