یکی از روش هایی که برای تشخیص ایمنی و کشف بیماری های موجود در خون استفاده می شود، تست الایزا یا Enzyme-linked immunosorbent است که در ادامه میخواهیم به توضیح بیشتری درباره تست الایزا و انواع آن بدانیم.
تست الایزا چیست؟
سنجش ایمونوسوربنت پیوندی با آنزیم (ELISA) یک سنجش ایمنی بسیار حساس است که برای تشخیص و تعیین کمیت مواد موجود در خون از جمله آنتی بادی ها، آنتی ژن ها، پروتئین ها، گلیکوپروتئین ها و هورمون ها استفاده می گردد. در این روش برای تشخیص این محصولات، از کمپلکس کردن آنتی بادی ها و آنتی ژن ها برای تولید یک نتیجه قابل اندازه گیری، استفاده می شود.
همانطور که میدانید آنتی بادی نوعی پروتئین است که توسط سیستم ایمنی بدن فرد تولید می شود و با دارا بودن مناطقی خاص، به آنتی ژن ها متصل می شود. آنتی ژن نیز پروتئینی است که می تواند از منبع خارجی به دست آید و وقتی به یک آنتی بادی متصل می شود، مجموعه ای از رویدادها را از طریق سیستم ایمنی بدن القا می کند که از این تعامل در آزمایش الایزا استفاده شده و امکان شناسایی آنتی بادی ها و آنتی ژن های پروتئینی خاص را تنها با مقادیر کمی از نمونه آزمایشی فراهم می کند. تست الایزا برای تشخیص عفونت HIV، آزمایش بارداری و تعیین گروه خونی و غیره کاربرد بسیاری دارد.
مراحل و وسایل مورد نیاز برای انجام تست الایزا
برای انجام تست الایزا به وسایل خاصی نیاز است که از مهم ترین آنها را می توان به موارد زیر اشاره کرد:
ELISA معمولاً در صفحات ۹۶ به شکل چاه برای اتصال به پروتئین بسیار قوی در صفحات پلی استایرن پوشش داده می شود و بسته به نوع تست الایزا برای آزمایش به مواردی چون آنتی بادی تشخیص اولیه یا ثانویه، آنالیت یا آنتی ژن، آنتی بادی یا آنتی ژن پوشش دهنده، بافر، شستشو و بستر یا کروموژن نیاز دارد.
چهار مرحله کلی برای تکمیل ایمونواسی الایزا وجود دارد که عبارت است از:
پوشش با آنتی ژن یا آنتی بادی
مسدود کردن (معمولاً با افزودن آلبومین سرم گاوی [BSA])
تشخیص
خواندن نهایی
یکسری نکات در خصوص انجام مراحل ایمونواسی الایزا وجود دارد که در ادامه به معرفی آنها می پردازیم.
اولین نکته ای که باید بدانید این است که انجام تشخیص، با افزودن زیرلایه ای انجام می شود که می تواند رنگ ایجاد کند؛ برای انجام اینکار بسترهای زیادی در تشخیص تست الایزا وجود دارد که از رایج ترین آن میتوان به HRP و ALP اشاره کرد. پس بستر HRP را میتوان یک بستر پراکسید هیدروژن دانست که باعث تغییر رنگ آبی می شود و رنگ زرد نیتروفنل را پس از دوره های انکوباسیون در دمای اتاق ۱۵ تا ۳۰ دقیقه اندازه گیری می کند.
دومین نکته در خصوص مرحله شستشو می باشد که بین هر یک از چهار مرحله فوق، شستشو صفحه با استفاده از یک بافر مانند سالین بافر با فسفات (PBS) و یک شوینده غیر یونی برای حذف مواد غیر متصل صورت می گیرد که بسته به پروتکل های خاص دنبال شونده، چاه ها دو یا چند بار در طول هر مرحله شسته می شوند.
در نهایت در مرحله خواندن نهایی تست الایزا، پس از اندازه‌گیری نتایج و با استفاده از منحنی استاندارد داده‌ ها با غلظت بر روی محور x با استفاده از مقیاس ورود به سیستم و جذب روی محور y با استفاده از مقیاس خطی رسم می‌شود.
انواع تست الیزا
۴ نوع عمده تست الایزا وجود دارد که عبارت است از:
الایزا مستقیم
در دو نوع تست الایزا مستقیم و غیر مستقیم انجام کار با پوشش آنتی ژن به صفحات الایزا شروع می شود. اولین مرحله اتصال شامل افزودن آنتی ژن به پلیت ها است که به مدت یک ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه می شود یا می توان یک شبه در دمای ۴ درجه سانتیگراد آن را انکوبه کرد. مرحله بعدی شستن پلیت ها از هر آنتی بادی غیرمجاز و مسدود کردن محل های غیر متصل در صفحه تست الایزا با استفاده از عواملی مانند BSA، اووالبومین، آپروتینین یا سایر پروتئین های حیوانی است. این مرحله از اهمیت بالایی برخوردار می باشد زیرا از اتصال هر گونه آنتی بادی غیر اختصاصی به صفحه جلوگیری می کند و نتایج مثبت کاذب را به حداقل می رساند. در ادامه پس از افزودن بافر، پلیت دوباره شسته و یک آنتی بادی تشخیص اولیه کونژوگه به آنزیم اضافه پلیت به مدت یک ساعت انکوبه می گردد.
در تست الایزا مستقیم، آنتی بادی تشخیص اولیه مستقیماً به پروتئین مورد نظر متصل می شود. در مرحله بعد، صفحه مجدداً شسته می‌شود تا هرگونه آنتی‌بادی غیرمجاز حذف شود و به دنبال آن یک سوبسترکروموفور مانند آلکالین فسفاتاز (AP) یا ترب‌پراکسیداز (HRP) به صفحه اضافه شده تا باعث تغییرگردد که این تغییر رنگ نمونه با هیدرولیز گروه های فسفات از بستر توسط AP یا با اکسیداسیون سوبستر توسط HRP اتفاق می افتد.
مزیت استفاده از از الایزا مستقیم، حذف واکنش متقاطع آنتی بادی ثانویه است و به دلیل انجام مراحل کمتر در مقایسه با الایزای غیرمستقیم اینکار سریع تر انجام می شود. البته از این نوع تست می توان به حساسیت کم آن نسبت به سایر انواع الایزا و هزینه بالای واکنش اشاره کرد.
الایزا غیر مستقیم
مراحل الایزای غیرمستقیم با الایزای مستقیم یکسان است به جز انجام یک مرحله شستشوی اضافی و انواع آنتی بادی که پس از حذف بافر اضافه می شود. در تست الایزا غیرمستقیم به دو آنتی بادی نیاز است، یک آنتی بادی تشخیص اولیه که به پروتئین مورد نظر می چسبد و یک آنتی بادی ثانویه مرتبط با آنزیم مکمل آنتی بادی اولیه. ابتدا آنتی بادی اولیه اضافه شده و یک مرحله شستشو انجام می گیرد و سپس آنتی بادی ثانویه کونژوگه به آنزیم اضافه و انکوبه می شود. پس از این مراحل، اوامه روش کاری مشابه الایزای مستقیم است.
این نوع تست در مقایسه با الایزا مستقیم از حساسیت بالاتری برخوردار است. همچنین به دلیل بسیاری از آنتی بادی های اولیه ممکن که می توان از آن استفاده کرد، ارزان تر و انعطاف پذیرتر است. تنها عیب عمده این نوع الایزا، خطر واکنش متقاطع بین آنتی بادی های تشخیص ثانویه است.
الایزا ساندویچ
برخلاف الایزای مستقیم و غیرمستقیم، الایزای ساندویچی با یک آنتی بادی جذب که روی چاهک های صفحه پوشانده شده است، شروع می شود که به آن “ساندویچ” می گویند؛ زیرا آنتی ژن ها بین دو لایه آنتی بادی (آنتی بادی های ضبط و تشخیص) قرار می گیرند. در ادامه پس از افزودن آنتی بادی جذب به پلیت ها، آنها را می پوشانند و یک شب در دمای ۴ درجه سانتی گراد انکوبه می کنند و هنگامی که مرحله پوشش کامل شد، صفحات با PBS شسته و سپس با BSA بافر مسدود می گردند. شستشوی بافر حداقل به مدت ۱-۲ ساعت در دمای اتاق انجام و در نهایت پلیت یکبار دیگر قبل از افزودن آنتی ژن با PBS، شسته می شود.
ساندویچ الایزا بالاترین حساسیت را در بین انواع الایزا دارد که از عمده معایب آن میتوان به زمان، هزینه و استفاده ضروری از “جفت همسان” (آنتی ژن دو ظرفیتی/چند ظرفیتی) و آنتی بادی های ثانویه اشاره کرد.
الایزا رقابتی
تست الایزا رقابتی برای وجود آنتی بادی اختصاصی برای آنتی ژن در سرم را آزمایش می کند. این نوع الایزا از دو آنتی بادی خاص، یک آنتی بادی کونژوگه با آنزیم و دیگری آنتی بادی موجود در سرم آزمایش (در صورت مثبت بودن سرم) استفاده می کند. ترکیب این دو آنتی بادی در چاهک ها امکان رقابت برای اتصال به آنتی ژن را فراهم می کند و وجود تغییر رنگ به این معناست که آزمایش منفی است زیرا آنتی بادی کونژوگه با آنزیم به آنتی ژن ها (نه آنتی بادی های سرم آزمایش) متصل می شود. همچنین عدم وجود رنگ، نشان دهنده مثبت بودن آزمایش و وجود آنتی بادی در سرم آزمایش است. از این نوع الایزا نمی توان در نمونه های رقیق استفاده کرد. با این حال، مزایا الایزای رقابتی این است که نیاز به خالص سازی نمونه کمتری وجود دارد و می توان طیف وسیعی از آنتی ژن ها را در یک نمونه مشخص اندازه گیری کرد و همچنین برای آنتی ژن های کوچک نیز کاربردی است.
سخن پایانی
میتوان نتیجه گرفت که تست الایزا یک آزمایش نسبتاً دقیق برای یک نمونه خونی است که در دور بالا، سانتریفوژ می‌شود. پس از جداسازی سرم خون از ذرات٬ یک ماده معرف(کانژوگه) به سرم خون اضافه می گردد تا محلول را برای تشخیص وجود پادتن‌های ضد ویروس موردنظر رنگی کند.